細菌RNA提取試劑盒（DNase I）說明書
RNApure Bacteria Kit（DNase I）
細菌RNA提取試劑盒（DNase I）
Cat. No. K0539
保存：DNase I、10×Reaction Buffer：-20℃
其它組分：室 溫
組分說明
Cat. No. k0539
Kit Size 50
DNase I 1000 U
10×Reaction Buffer 1000 μl
Buffer RL 35 ml
Buffer RW1 40 ml
Buffer RW2（concentrate） 11 ml
RNase-Free Water 10 ml
Shredder Spin column 50
Spin Column RM 50
Collection Tube（1.5 ml） 50
Collection Tube（2 ml） 100
產品簡介
本試劑盒采用高效、專一結合核酸的離心吸附柱和*的緩沖系統，可從細菌或培養的動物細胞中快速提取總 RNA。30-40 分鐘內即可完成反應，提取的總 RNA 純度*，沒有蛋白質和其他污染，適用于 RT-PCR、Real-Time RT-PCR、芯片分析、體外翻譯等實驗。
注意事項
1. 預防RNase污染，應注意以下幾方面：
1）使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。
2）玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。
3）配制溶液應使用無RNase的水。
4）操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。
2. Buffer RL 在使用前請加入β-巰基乙醇至終濃度為 1%，如 1 ml Buffer RL 加 10 μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的
Buffer RL 4℃可保存 1 個月，如出現沉淀，請加熱溶解后使用。
3. 第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。
5. 如未特殊說明，所有離心步驟均在室溫下進行，且所有操作步驟動作要迅速。
自備試劑：Lysozyme（YJ0887）、β-巰基乙醇、無水乙醇（新開封或提取RNA專用）
操作步驟
1. 4℃ 10,000 rpm（~13,400×g）離心2分鐘收集菌體（菌體量最大不超過1×109 ），小心去除所有上清。
注意：上清如果有殘留，會影響后續的消化過程。
2. 用含有Lysozyme的100 μl TE緩沖液*重懸菌體，室溫孵育。具體配方和孵育時間如下：
TE 緩沖液中 Lysozyme 的終濃度 孵育時間
G 細菌 400 μg/ml 3-5 分鐘
-
G+ 細菌 3 mg/ml 5-10 分鐘
3. 加入350 μl裂解液RL（使用前請檢查是否加入β-巰基乙醇），渦旋震蕩混勻（此步驟可能出現不溶性沉淀），將溶液與沉淀全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的過濾柱（Shredder Spin Column）中，10,000 rpm離心 2分鐘。
4. 向上步得到的濾液中加入250 μl無水乙醇，混勻（此時可能會出現沉淀）。將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱（Spin Column RM）中（吸附柱已裝入2 ml收集管中），10,000 rpm離心1分鐘，棄掉廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
5. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，10,000 rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
6. 配制DNase I 混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8 μl 10×Reaction Buffer 和20 μl DNase I（1U/μl），混勻， 配制成終體積為80 μl的反應液。
7. 向吸附柱中直接加入80 µl DNase I 混合液，20-30℃孵育15分鐘。
8. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，10,000 rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
9. 向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2（使用前檢查是否加入無水乙醇）, 10,000 rpm離心1分鐘,棄廢液。
10. 重復步驟9。
11. 將吸附柱放回收集管中，10,000 rpm離心2分鐘。
注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇殘留會影響后續的酶促反應(酶切、PCR等)。
12. 將吸附柱裝入新的RNase-Free的1.5 ml 收集管中，向吸附膜的中間加入30-50 μl RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，10,000 rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
注意：1） RNase-Free Water 體積不應小于 30 μl，體積過小影響回收率。
2） 如果要提高RNA的產量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重復步驟12。
3） 如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復步驟12。
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