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產(chǎn)品名稱：狗腫瘤浸潤組織白細(xì)胞分離液試劑盒

（細(xì)胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)）說明書

【產(chǎn)品組成】

為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：

 名稱 產(chǎn)品編號(hào) 規(guī)格

A 各種動(dòng)物外周血白細(xì)胞分離液 詳見附錄 1 2×100ml

B 紅細(xì)胞裂解液（贈(zèng)品） NH4CL2009 100ml

C 全血及組織稀釋液（贈(zèng)品） 2010C1119 100ml

D 細(xì)胞洗滌液（贈(zèng)品） 2010X1118 100ml

注：本試劑內(nèi)容中各單品可根據(jù)貨號(hào)單獨(dú)購買，客戶可根據(jù)實(shí)際使用情況自行選擇購買。

【預(yù)期用途】

適用于從動(dòng)物抗凝血液中分離白細(xì)胞，無菌條件下所分離的白細(xì)胞可用于分子生物學(xué)及

細(xì)胞培養(yǎng)等。本品僅供科研使用。

【檢驗(yàn)原理】

本分離液為 FICOLL、羥乙一基淀粉 550 與泛影酸葡甲胺的混合液。抗凝血液可在分離液

中分層。離心時(shí)，在 FICOLL、羥乙一基淀粉的作用下紅細(xì)胞與粒細(xì)胞聚集并迅速沉降；此時(shí)，

白細(xì)胞仍處于分離液上層及分離液層，紅細(xì)胞污染可通過紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞去除。大

部分血小板可在細(xì)胞清洗低速離心過程中去除。

其他人及動(dòng)物多種比重細(xì)胞分離液，因不同種屬不同比重分離液的細(xì)胞離散系數(shù)及細(xì)胞

帶電不同，用戶在制定分離液時(shí)應(yīng)提供所需分離液的比重、動(dòng)物種屬及被分離細(xì)胞的名稱。

【*但不提供的儀器及耗材】

可提供 400g 離心力的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)、15ml 玻璃離心管、吸管等。

【注意事項(xiàng)】

1. 使用前，本分離液需復(fù)溫至 18-22℃。為獲得*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在取血后 2 小時(shí)內(nèi)

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液提取后存放時(shí)間越長細(xì)胞活性越低。

2. 實(shí)驗(yàn)過程中，如需稀釋血液或洗滌細(xì)胞，不可使用含 Ca、Mg 離子的緩沖液及培養(yǎng)液，其

成分會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞凝集大大降低細(xì)胞得率及純度。本公司生產(chǎn)的全血及組織稀釋液和細(xì)胞洗

滌液不含 Ca、Mg 離子、低內(nèi)毒素水平且含細(xì)胞和保護(hù)成分，推薦使用。

3. *抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素，其他抗凝劑也可使用，但會(huì)影響細(xì)胞活性。應(yīng)

注意在血液稀釋過程中去除抗凝劑體積。

4. 當(dāng)血液樣本粘度過高或血液樣本大于等于 3ml 時(shí)，*稀釋方法：將血液于 18-22℃以

250g 離心 10 分鐘，棄去血漿，補(bǔ)充添加全血及組織稀釋液（產(chǎn)品編號(hào)：2010C1119），添

加量為所棄去血漿體積的 1.5-2 倍，混勻備用。注：不當(dāng)?shù)南♂尫椒〞?huì)降低細(xì)胞得率及活性。

5. 實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，不可使用含粉手套、不可使用內(nèi)毒素含量過高的液體，手套中的粉末顆粒

及高內(nèi)毒素會(huì)激活細(xì)胞從而降低細(xì)胞得率及活性。

6. 本實(shí)驗(yàn)不可使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，其帶有的靜電作用將導(dǎo)致細(xì)胞

貼壁影響分離效果。

7. 吸取過多的白細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)

胞數(shù)量增加。

8. 吸取過多的白細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。

9. 如需進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，則需血液貯藏時(shí)間不得多于 10 小時(shí)，否則將導(dǎo)致細(xì)胞被激活，得率降低。

10. 為去除所混雜的血小板，可在分離液上層加上 4-20%蔗糖梯度等滲溶液進(jìn)行二次離心。

11. 細(xì)胞純度可在步驟 10 后使用瑞氏染色方法確定，細(xì)胞活性可用臺(tái)盼藍(lán)處理后觀察。

12. 如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低，請(qǐng)?zhí)旖驗(yàn)笠詫で髱椭?，具體

詳見“【生產(chǎn)企業(yè)】”項(xiàng)目下內(nèi)容。

【檢驗(yàn)方法】

情況 A: 血液樣本小于 3ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：

1. 取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液置于 18-22℃。

2. 將血液樣本小心加于分離液之液面上。18-22℃，400g 離心 20 分鐘。低溫（如 4 度）離

心會(huì)降低細(xì)胞得率。

3. 離心后，用吸管小心吸出分離液上層（包含白細(xì)胞的細(xì)胞層）0.5cm 以上的上清液部分，

棄去。

4. 用吸管小心吸取分離液層、白細(xì)胞層及紅細(xì)胞層置于另一新離心管內(nèi)。

5. 在步驟 4 中所得離心管中加入 10ml 細(xì)胞洗滌液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）混勻。

6. 250g 離心 10 分鐘。

7. 棄上清，沉淀使用紅細(xì)胞裂解液（Cat#：NH4CL2009）裂解紅細(xì)胞（裂解過程參見下述【紅

細(xì)胞裂解液使用說明】）。

8. 裂解后再經(jīng)三次洗滌去除紅細(xì)胞內(nèi)溶物和碎片后即為所需白細(xì)胞。

9.后以 0.5ml 后續(xù)試驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

情況 B: 血液樣本大于等于 3ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：

1. 首先按“【注意事項(xiàng)】第 4 條”所述方法稀釋血液樣本。

2. 取一支適當(dāng)?shù)碾x心管，加入分離液（加入量與稀釋后的血液樣本體積相等），置于

18-22℃。

3. 將經(jīng)稀釋處理的血液樣本小心加于分離液之液面上。18-22℃，400g 離心 20 分鐘。低溫

（如 4 度）離心會(huì)降低細(xì)胞得率。注：加入血液樣本后，樣本及分離液總體積不得超過

離心管總體積的三分之二。

4. 剩余步驟同“情況 A”中步驟 3 至步驟

【紅細(xì)胞裂解液使用說明】

本裂解液有別于市場上銷售的其它紅細(xì)胞裂解液，其配方經(jīng)過本公司優(yōu)化在裂解紅細(xì)

胞的同時(shí)不損傷并在一定程度上保護(hù)淋巴細(xì)胞(lymphocyte)或其它有細(xì)胞核的細(xì)胞，所獲

得的細(xì)胞可保持完好的生物活性和完整的細(xì)胞形態(tài)。另外，本裂解液中無DNA及RNA酶，配

合細(xì)胞分離液使用所提細(xì)胞可廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)廣大用戶從優(yōu)選擇。

紅細(xì)胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)，也稱ACK Lysis Buffer，是一種用于

從人或鼠等的血液或組織細(xì)胞樣品中裂解并去除無細(xì)胞核紅細(xì)胞的溶液。

本裂解液不適用于有細(xì)胞核紅細(xì)胞的裂解，例如鳥或禽類的紅細(xì)胞。本裂解液經(jīng)過無菌

處理，處理過的血液或組織細(xì)胞樣品可以用于后續(xù)的原代培養(yǎng)、細(xì)胞融合以及核酸或蛋白的

提取及各種常規(guī)的分析和檢測。

使用說明：

A. 對(duì)于組織細(xì)胞樣品：

a. 新鮮組織經(jīng)過膠原酶或胰酶等消化處理，通過適當(dāng)方法分散成細(xì)胞懸液，離心棄上清。

b. 加入3-5倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細(xì)胞沉淀的體

積為1ml，則加入3-5ml的紅細(xì)胞裂解液。本步驟在室溫或4度操作均可。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細(xì)胞不

會(huì)影響后續(xù)的一些檢測。

e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，重懸沉淀，400-500g離心

2-3分鐘，棄上清?？稍僦貜?fù)1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應(yīng)至少為細(xì)胞沉淀

體積的5倍。4℃離心效果更佳。

White Blood

Cell

f. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

B. 對(duì)于組織細(xì)胞樣品無需洗滌的快速操作步驟：

a. 新鮮組織經(jīng)過膠原酶或胰酶等消化處理，通過適當(dāng)方法分散成細(xì)胞懸液，離心棄上清。

b. 對(duì)于0.2ml細(xì)胞沉淀加入1ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。本步驟在室溫

或4度操作均可。

c. 加入15-20ml PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，混勻。

d. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

e. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細(xì)胞不

會(huì)影響后續(xù)的一些檢測。

f. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：對(duì)于常規(guī)步驟，多一步洗滌過程中的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更好一些，同

時(shí)不需要大體積的離心管。快速步驟少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時(shí)需要大體積的離心管。

C. 對(duì)于血液樣品：

a. 取新鮮抗凝血，400-500g離心5分鐘，離心棄上清。

b. 加入6-10倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細(xì)胞沉淀的體

積為1ml，則加入6-10ml的紅細(xì)胞裂解液。本步驟在室溫或4度操作均可。注意：對(duì)于鼠

的血液，裂解1-2分鐘已經(jīng)足夠，對(duì)于人的外周血，宜延長裂解時(shí)間至4-5分鐘，并且裂

解過程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細(xì)胞不

會(huì)影響后續(xù)的一些檢測。

e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，重懸沉淀，400-500g離心

2-3分鐘，棄上清?？稍僦貜?fù)1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應(yīng)至少為細(xì)胞沉淀

體積的5倍。4℃離心效果更佳。

f. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：對(duì)于微量或少量的血液樣品，可以在*步中不進(jìn)行離心棄上清的操作，直接在第二步中加入10倍血

液體積的紅細(xì)胞裂解液，并在室溫或4℃裂解4-5分鐘。對(duì)于鼠的血液，裂解4-5分鐘已經(jīng)足夠，對(duì)于人的外

周血，宜延長裂解時(shí)間至10分鐘，但通常不宜超過15分鐘，并且裂解過程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。后續(xù)步驟相同。

D. 對(duì)于血液樣品無需洗滌的快速操作步驟：

a. 每1ml新鮮抗凝血中加入10ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解4-5分鐘。

溫或4度操作均可。注意：對(duì)于鼠的血液，裂解4-5分鐘已經(jīng)足夠，對(duì)于人的外周血，宜

延長裂解時(shí)間至10分鐘，但通常不宜超過15分鐘，并且裂解過程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促

進(jìn)紅細(xì)胞裂解。

b. 加入20-30ml PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，混勻。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細(xì)胞不會(huì)影響后續(xù)的一些檢測。

e. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：對(duì)于常規(guī)步驟，多一步洗滌過程的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更好一些，同時(shí)

不需要大體積的離心管。快速步驟少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時(shí)需要大體積的離心管。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

18-25℃避光保存，有效期 2 年。啟封后置 4℃保存，溶液變渾濁或感染細(xì)菌時(shí)，產(chǎn)品

失效。本品為真空包裝，未啟封前置于 10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

【適用儀器】

半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)。

【樣本要求】

本分離液要求血液為新鮮的抗凝血，血液收集時(shí)應(yīng)無菌操作且在儲(chǔ)存、處理和運(yùn)輸過

程中避免冷凍和冷藏。

【參考值（參考范圍）】

本實(shí)驗(yàn)白細(xì)胞的提取率及純度均大于 80%。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

由于各品牌離心機(jī)的性能不同，國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響分離效

果，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心的時(shí)間，摸索*的分離條件（具體分離條件各實(shí)驗(yàn)室自

定）。

【檢驗(yàn)方法的局限性】

本試驗(yàn)要求，在正常大氣壓下，樣本、分離液及分離環(huán)境溫度為 18-22℃。本分離液在

低溫時(shí)呈較高密度，在高溫時(shí)呈較低密度。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

無菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清

澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μ m 以上的不溶性微粒 20 粒以下，含

μ m 以上的不溶性微粒 5 粒以下

【參考文獻(xiàn)】

1 鄭德先，吳克復(fù)，褚建新.現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)血液學(xué)研究方法與技術(shù).北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大

學(xué)聯(lián)合出版社，1999

2 鄂征.組織培養(yǎng).北京出版社，1995

3 朱立平，陳學(xué)清.免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法.人民軍醫(yī)出版社，2000